線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)詳細介紹

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中文名：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)

供應商：上海遠慕

規(guī)格：50T/100T

分類：細胞檢測

保存：—20℃,避光,12個月

保存說明： -20℃保存。JC-1(200X)需避光保存，并盡量避免反復凍融。超純水和JC-1染色緩沖液(5X)也可4℃保存。

用途:細胞凋亡的生物化學分析,線粒體膜電位檢測

組成：主要由JC-1染料儲存液,JC-1 buffer、CCCP等組成,可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位,采用FACS檢測。

適用范圍：限于科研，實驗，不作臨床

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)詳細介紹

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)說明

1、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) 是一種以JC-1為熒光探針，快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。

2、通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。 

3、JC-1是一種檢測線粒體膜電位的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物，產生紅色熒光；

4、在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1為單體，產生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。

5、JC-1單體的zui大激發(fā)波長為514nm，zui大發(fā)射波長為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的zui大激發(fā)波長為585nm，zui大發(fā)射波長為590nm。實際觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。

6、本試劑盒提供了CCCP作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。對于六孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測100個樣品；對于12孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測200個樣品。

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)操作步驟

1，配制JC-1染色工作液

a、六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mLJC-1染色工作液。

b、取適量JC-1（200×），按照每50µLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

2，陽性對照的設置

把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照11000∶的比例加入到細胞培養(yǎng)液中， 稀釋至10µM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。

3，對于懸浮細胞

a、取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

b、加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。

c、在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

d、37℃孵育結束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。 （5）用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。

e、再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4，對于貼壁細胞

注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，應先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。

a、吸除6孔板培養(yǎng)液，根據具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1ml細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

b、加入1ml JC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育。

c、在孵育期間，按照每1ml JC-1 Buffer(5×)加入蒸餾水的比例，配制適量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。

d、37℃孵育結束后， 吸除上清，用JC-1 Buffer(1×)洗滌2次。

e、加入2ml細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

f、熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5，對于純化的線粒體

a、把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀釋5倍。

b、0.9ml 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1ml總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。

c、用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描，激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為485nm時，可以在475～520nm范圍內設置激發(fā)波長。

d、用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6，熒光觀測和結果分析

檢測JC-1單體時可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設置為525nm，發(fā)射光設置為590nm。

注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在zui大激發(fā)波長和zui大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設置。

出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。 

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)注意事項 

1，JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2，請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

3，如JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進溶解可以在37℃加熱。 JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30分鐘內完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存。 

4，應避免反復凍融。不可先配制JC-1 Buffer(1×)再加入JC-1 Stain(200×)，否則導致JC-1很難充分溶解，嚴重影響后續(xù)的檢測?？梢?0～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用.

5，裝載完JC-1后用JC-1 Buffer(1×)洗滌時，盡量使JC-1 Buffer(1×)保持4℃左右，此時的洗滌效果較好。

6，CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

 7，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

標簽：線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1法)