ELISA是一個間接的檢測過程，這在很多文獻資料上都有這樣的記載。但是很少有研究資料詳細的描述間接測量的信號傳遞過程，以及傳遞過程中出現的偏差。這里小編從宏觀和微觀兩個角度對ELISA進行系統分析，該分析有助于搭建穩定的ELISA平臺，并正確地使用和評估不tong性質的酶聯抗體和顯色液等通用材料。
宏觀上來講，ELISA檢測的函數曲線在實際操作過程中描述的是劑量濃度的抗體和信號之間的相關關系，而其實質是為了描述劑量濃度的抗體和對應抗原-抗體偶聯物之間的相關關系。抗原-抗體偶聯物經過了酶聯抗體反應和酶催化放大反應，催化產物檢測后轉換成信號。該信號間接的代表了抗原-抗體偶聯物。這種間接的轉化過程經歷了三重信號的傳遞過程，而只有在三重傳遞保證線性的情況，抗體濃度-信號劑量曲線才能等同于抗體濃度-抗體抗原偶聯物濃度劑量曲線，如果進行了非線性傳遞將會影響到整個檢測方法的真實性和準確性，下面小編將從微觀角度簡單介紹下信號傳遞過程中可能存在的偏差。
1.信號檢測偏差：酶催化產物轉換成信號時有可能會產生的偏差，這個偏差在一些文獻中也稱之為儀器的非線性檢測區域，即當酶催化產物濃度過高時，催化產物濃度和信號值之間不*呈線性關系，這個現象是普遍存在的，某品牌酶標儀的參數性能，注意該儀器的測量范圍是0-4 OD，而該儀器確保的檢測線性范圍是0-3 OD。一般來講在進行吸光度法讀數時，檢測的信號值gao值控制在3左右。如果兩個相鄰的抗體濃度點對應的信號值在OD值3.5及以上時都會特別接近，這兩個信號值很有可能是有信號傳遞偏差的。這個可以通過高濃度的酶催化產物梯度稀釋查看信號的線性范圍確認。
2.酶催化反應傳遞偏差：該偏差是由酶催化顯色液引起的，其實質是酶聯抗體的濃度和其對應催化產物的濃度是否線性相關。由于酶催化反應在未終止前是一個持續反應的信號放大過程，信號的產生是時間的累積量，在反應過程中酶活可能會喪失顯色液的有效成分在不斷的減少時，梯度濃度的酶催化反應在反應時間內的可能不會是勻速反應狀態。
這個可以通過動力學讀數進行確認。目前市面上有多種顯色液可供選擇，顯色能力qiang和弱的產品信號差異可能達到20-50倍，需要根據實驗的目的正確的選擇顯色液并確認酶催化過程的線性傳遞。
3.酶聯抗體反應傳遞偏差，即酶聯抗體和抗體抗原偶聯物反應后，酶聯抗體-抗原抗體偶聯物的濃度能否線性的代表抗體抗原偶聯物的濃度。這個比較復雜的過程，主要是因為酶聯抗體的異質性導致的，酶聯抗體多為多抗，該抗體偶聯上的HRP分子數目也存在差異，很難用單一的實驗去論證這個線性過程。但值得注意的是，酶聯抗體加入反應濃度應該遠大于抗體抗原偶聯物的濃度，這樣能夠保證基本所有的抗體抗原偶聯物都被轉換成酶聯抗體-抗原抗體偶聯物，酶聯濃度加入過少會導致劑量曲線的高濃度點出現假平臺期，影響實驗的結果；酶聯濃度過高可能會導致非特異信號的增加，還有酶聯濃度的增加會導致信號的增加，可能會導致信號值超過線性檢測范圍。所以酶聯濃度的反應濃度是一個值得選擇的參數。
