抗原修復(fù)就是利用虎穴試劑盒熱的作用將抗原重新暴露出現(xiàn)或修正過(guò)來(lái)的過(guò)程。
常用抗原修復(fù)法介紹：
1. 真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：
① 切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95℃，真空負(fù)壓處理10分鐘。
⑤待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的年免疫組化染色方法進(jìn)行染色。這是一種操作簡(jiǎn)單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。
2.微波輻射抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測(cè)Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。
⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色。
3.高壓抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4分鐘。
⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。
4.隔水熱抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計(jì)測(cè)其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后（92℃↑）。即開(kāi)始計(jì)時(shí)，持續(xù)40分鐘。⑤待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。
5.電爐加熱抗原修復(fù)法：
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來(lái)水洗，蒸餾水洗。
④ 將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時(shí)用溫度計(jì)測(cè)量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時(shí)，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。
⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。對(duì)各種抗原修復(fù)方法的評(píng)價(jià)。
抗原修復(fù)的方法選擇：
抗原修復(fù)關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色效果有很大影響。不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式會(huì)導(dǎo)致染色弱陽(yáng)性。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式會(huì)導(dǎo)致染色弱陽(yáng)性。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對(duì)某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細(xì)胞間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同，所檢測(cè)抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原，如Keratin，CEA，GFAP等。一般說(shuō)來(lái)，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化，如fibronectin，Laminin，各型膠原等。消化時(shí)間和組織固定的長(zhǎng)短呈正比。在用酶消化，熱修復(fù)后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復(fù)與酶消化結(jié)合的方法，有時(shí)會(huì)取得較為滿意的結(jié)果。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合，但應(yīng)注意，可能檢測(cè)的抗原無(wú)論何種性質(zhì)均會(huì)在核內(nèi)出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定,?高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對(duì)修復(fù)效果無(wú)任何影響，而PH值則影響較大。緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。
免疫組化抗原修復(fù)法的注意事項(xiàng)：
1、pH的應(yīng)用范圍及選擇抗原修復(fù)液的pH非常重要，有效的抗原修復(fù)pH要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著pH的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但jiapH范圍為6.0-10.0。目前大家*的hao的抗原修復(fù)液是pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液。作為通用修復(fù)液堿性pH的修復(fù)液要比酸性的有效，而對(duì)固定很長(zhǎng)時(shí)間舊的存檔組織，酸性pH的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修復(fù)液。
2、抗原修復(fù)時(shí)應(yīng)選擇jia溫度70-90℃的溫度對(duì)未經(jīng)固定的蛋白質(zhì)可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白質(zhì)，溫度必須達(dá)到92℃以上方能使其變性。研究結(jié)果顯示，溫度為92-98℃是合適的，95℃效果hao。
3、抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的抗原修復(fù)持續(xù)時(shí)間過(guò)后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，不能為了爭(zhēng)取時(shí)間，強(qiáng)行用冰塊或冷水使其降溫。這是因?yàn)楫?dāng)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個(gè)自然環(huán)境讓其自然放松下來(lái)，隨著溫度的降低，它們會(huì)慢慢地恢復(fù)原來(lái)的形態(tài)和構(gòu)型。
4、盡量使用足量的抗原修復(fù)液應(yīng)用于抗原修復(fù)的液體，一定要充足，防止切片干涸。應(yīng)用大量的抗原修復(fù)液時(shí)，由于它的量較大，可延緩液體的沸騰時(shí)間，增加切片受微波輻射的量，對(duì)抗原修復(fù)將達(dá)到*。
