PCR 是一個(gè)坑，坑里埋了好多研究僧……
PCR 是眾位「研究僧」日常實(shí)驗(yàn)中常用的技術(shù)，可謂是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，這道菜不hao吃，一不小心就「小河里翻船」。
那么，我們該如何把這道菜「吃好」、跳出這個(gè)「坑」呢？
諸位看官莫急，待我送君「三大fa寶」。
一、確保 RNA 樣本合格
常見的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，這兩個(gè)方法各有所長，但都不能保證提取的 RNA 樣本一定合格。
因而，提取完成后應(yīng)測定 RNA 的濃度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 處分別測定其吸光度（A260、A280、A230）并計(jì)算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。
那么，這幾個(gè)數(shù)值及其比值分別有何意義？
A260 為核酸的吸光度，A280 為蛋白質(zhì)的吸光度，A230 為其他雜質(zhì)（多糖等）的吸光度。純 DNA 的 A260 /A280 為 1.8，純 RNA 的 A260 /A280 為 2.0。
如果 OD 比值不在范圍內(nèi)該如何解決呢？
再次洗滌樣本！
75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗滌；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗滌兩次。洗滌后離心時(shí)可兩次分別將 EP 管置于不同的方向，便于*洗滌 RNA 樣本。通常洗滌兩次后可使測得的 OD 值較為理想。
二、 利用「RNAstructure」軟件
引物，是進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)的*條件。其特異性的問題可通過「BLAST」搞定，讓人比較頭痛的是引物可以形成「發(fā)夾結(jié)構(gòu)」或「二聚體」（即在＜75℃ 時(shí)出現(xiàn)溶解曲線的峰），影響擴(kuò)增效率，終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可用。
那么，這個(gè)問題能否解決呢？
有！設(shè)計(jì)引物的時(shí)候用「RNAstructure」預(yù)測一下引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)即可。
那么，這個(gè)軟件要如何使用呢？
1. 打開「RNAstructure」，單擊左上角的「new sequence」按鈕：
2. 新建序列文件，會(huì)出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話框，輸入待檢測的引物序列：
3. 單擊「Fold as DNA」，「save changes」，出現(xiàn)新的對(duì)話框后直接點(diǎn)擊「Start」：
4. 無需更改其他參數(shù)，再次點(diǎn)擊「Draw structure」，即可得到目標(biāo)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)：
若考察引物能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，則直接檢測 Forward 或 Reverse 引物即可。
若考察引物能否形成二聚體，則把兩條引物一起輸入，視作一條序列進(jìn)行檢測即可。
在得到二級(jí)結(jié)構(gòu)圖后，只要沒有連續(xù) 4 個(gè)以上的配對(duì)即可；若一條引物長度為 20 bp，在 18～22 處有連續(xù) 5 個(gè)的堿基配對(duì)，則可「手動(dòng)拆解配對(duì)」，即保證引物為兩條鏈時(shí)的配對(duì)不多于 4 個(gè)即可。
三、保證擴(kuò)增效率符合要求
有童鞋反映，兩個(gè)同類基因測試同一批樣本，理論上趨勢應(yīng)該一致，結(jié)果卻是兩種趨勢，應(yīng)該相信哪個(gè)呢？
不知道各位看官有沒有遇到類似的問題？這類問題該如何解決呢？
先說說出現(xiàn)這類問題的原因吧：
1. 擴(kuò)增條件非*；
2. 樣本中含有抑制擴(kuò)增的物質(zhì)，如乙醇。
一對(duì)引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值時(shí)未必是其*擴(kuò)增溫度。溫度過高時(shí)，擴(kuò)增效率過低，差異部分的目的基因不能被擴(kuò)增，導(dǎo)致「假陰性」結(jié)果的出現(xiàn)。
那么，如何確定擴(kuò)增效率是否滿足要求呢？
通常，拿到新引物后應(yīng)從 Tm- 5℃ 尋找其適宜的擴(kuò)增溫度，在某溫度起為特異性擴(kuò)增。
然后，在特異性擴(kuò)增的溫度下檢測擴(kuò)增效率：將 cDNA 梯度稀釋（一般為 2×），測試稀釋后的樣本 Ct 值差異是否為 1 左右。
若差值為 1，則擴(kuò)增效率良好，可進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。
若在特異性擴(kuò)增的溫度范圍內(nèi)不能使 Ct 值差異為 1，則需考慮重新設(shè)計(jì)引物。
