*，Western blot(WB)和免疫組化(IHC)都屬于免疫學常用的實驗技術。WB是通過SDS-PAGE分離蛋白質樣品，然后轉移到固相載體上，利用抗原與抗體特異性結合的原理進行樣品檢測，可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，對組織（細胞）內抗原進行定位、定性及通過Image J進行定量的研究(主要是定位)。與WB相比，IHC實驗步驟復雜，涉及的試劑和物品種類繁多，所以IHC的垃圾分類更要認真對待。那么，IHC實驗中的垃圾到底有哪些？又該如何分類呢？遠慕小編從IHC的實驗步驟開始和大家逐一敘述。

 

IHC(石蠟切片)都有哪些步驟
一、 石蠟組織切片制作
固定：使組織樣本盡量保持其離體前狀態，多采用4%多聚甲醛固定液。
脫水：水和透明劑不能互溶，只有脫去水分后，才能讓透明劑進入。使用梯度乙醇進行脫水。75%、85%、95%、100%、100%乙醇，每步1h-2h左右。
透明：乙醇不能與石蠟相溶，還需用能與乙醇和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的乙醇。二甲苯是常用的透明劑，可以很好地與石蠟互溶。將組織依次放入二甲苯與無水乙醇的等體積混合液、純二甲苯和純二甲苯中進行透明。
浸蠟與包埋：用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，便于在切片機上夾持切片。用于包埋石蠟的熔點在50~60℃之間。
切片：將包埋組織的蠟塊固定在切片機上，切片厚度一般為4~8μM。
貼片：把切片放入50℃水中，攤平后用多聚賴氨酸處理過的載玻片撈起，室溫晾干。


二、 脫蠟復水
干燥后的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。如果不經過復水，直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。
先烤片，將切片放于60℃烘箱中烘烤。
二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各10~15min。
放入100%、100%、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。
放入蒸餾水洗兩次×5min。PBS（或PBST）洗三次×3 min。


三、 抗原修復
甲醛的固定使細胞內抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發生交聯而使抗原決定簇隱蔽。在染色前需進行抗原修復或暴露。
將切片浸入0.01M檸檬酸鹽緩沖液中，再放入微波爐中加熱10 min，之后冷卻切片。或者，用EDTA-胰蛋白酶消化液37℃消化10 min。
PBS（或PBST）洗三次×3 min。用吸水紙將切片組織周圍擦干。


四、 滅活內源性過氧化氫酶
去除組織中的內源性酶催化底物，避免染色的非特異性。
用免疫組化筆圈出樣品，滴加3%過氧化氫溶液孵育10min。
PBS（或PBST）洗三次×3 min。


五、 封閉
為減少背景產生的非特異性染色，使用非免疫動物血清進行封閉。
滴加動物血清封閉液，室溫封閉30min。
甩去多余液體，用吸水紙將切片組織周圍擦干。


六、 抗體結合
滴加一抗，4℃孵育過夜。
PBS（或PBST）洗三次×3 min。
滴加辣根酶標記的二抗，37℃孵育30min。
PBS（或PBST）洗三次×3 min。


七、 底物顯色
DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，然后PBS或自來水沖洗1min。


八、 復染
襯托出組織細胞的形態結構，更好地對目標蛋白進行定位。
蘇木素復染1-3min。
PBS或自來水沖洗1min。

九、 分化
1%的鹽酸酒精分化2～3秒，PBS或自來水沖洗兩次×5min。


十、 脫水和透明
75%，85%，95%，100%，100%的乙醇浸泡各2min。
二甲苯浸泡兩次×2min。


十一、 封片
用蓋玻片和中性樹膠進行封片。之后鏡檢。
IHC(冰凍切片)實驗怎么做
一、冰凍
將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內（直徑約2cm），如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內，當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。取出組織冰塊立即置入-80℃冰箱貯存備用，或置入恒冷箱切片機冰凍切片。
注意：針對儲存在-80℃溫度下的組織，切片前，從冷凍柜中取出組織樣品，在-20℃的溫度下均衡約15分鐘。這樣可以防止切片在封閉時破裂。


二、切片
用OCT包埋劑浸沒組織。將組織切成厚度在6-8μm之間的切片，置于多聚賴氨酸粘附的載玻片上。固定前，將切片放置在工作臺上風干幾分鐘（這樣可以增加切片的粘附作用）。


三、固定
選擇適宜的固定劑，可采用丙酮固定，-20℃下冷凍10分鐘，風干。
之后，同上面實驗步驟：滅活內源性過氧化氫酶→封閉→抗體結合→底物顯色→復染→分化→脫水透明→封片→鏡檢。