實驗概要
本實驗包括大腸桿菌質粒DNA的提取，質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定，大腸稈菌感受態細胞的制備及質粒DNA高頻轉化大腸桿菌。

實驗步驟
1. 大腸桿菌質粒DNA的提取
堿裂解法：此方法適用于小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用于酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：
1) 接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2ml LB培養基。
2) 37℃振蕩培養過夜。
3) 取1.5ml菌體于Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。
4) 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5) 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min 。
6) 加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5 min 。
7) 以10，000rpm離心20min，取上清液于另一新Ep管
8) 加入等體積的yi戊醇，混勻后于0℃靜置10min。
9) 再以10，000rpm離心20min，棄上清。
10) 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。
11) 待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE緩沖液中

煮沸法：
1) 將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000ｇ離心30秒。
2) 棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3) 將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中，渦旋混勻。
4) 加入10ml新配制的溶jun酶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3秒鐘。
5) 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。
6) 用微量離心機4℃下12000g離心10分鐘。
7) 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8) 取20ml進行電泳檢查。

注意：
1) 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。
2) 煮沸法中添加溶菌jun酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶jun酶也能溶菌。
3) 提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA并不干擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等。

2. 質粒DNA的大量提取和純化
在制作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA，為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。

1) 堿法
A. 取培養至對數生長后期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鐘，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。
B. 將細菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
C. 同步驟A方法離心以收集細菌細胞。
D. 將細菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。
E. 加入12ml新配制的溶液II，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數次，以充分混勻內容物，冰浴10分鐘。
F. 加9ml用冰預冷的溶液III，搖動離心管數次以混勻內容物，冰上放置15分鐘，此時應形成白色絮狀沉淀。
G. 4℃下5000g離心15分鐘。
H. 取上清液，加入50ml RNA酶A(10mg/ml)， 37℃水浴20分鐘。
I. 加入等體積的飽和酚/氯/仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
J. 取上層水相，加入等體積氯/仿，振蕩混勻，4℃下12000g離心10分鐘。
K. 取上層水相，加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000)，冰上放置60分鐘。
L. 4℃下12000g離心15分鐘，沉淀用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
M. 真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。

注意：
1) 提取過程中應盡量保持低溫。
2) 加入溶液II和溶液III后操作應混和，切忌劇烈振蕩。
3) 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃ 1小時)，使DNA酶失活。

3. 質粒DNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定

4. 大腸稈菌感受態細胞的制備
感受態的細胞可以攝入外部溶液中的DNA，而常態的細胞卻不能，所以要轉化質粒DNA進入大腸桿菌必須首先制備感受態的大腸桿菌細胞。
1) 取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。
2) 取0.1ml過夜培養物轉種于含10ml LB培養基的三角瓶中，37℃振蕩培養3h至OD600=0.3。
3) 然后把培養物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。
4) 在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液。
5) 把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min。
6) 然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液。
7) 將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。

5. 質粒DNA高頻轉化大腸桿菌
制備好感受態細胞后，接下來就是質粒DNA轉化入大腸桿菌細胞的過程。但要注意的是感受態細胞最/好是新制備的，因為保存一定時間的感受態細胞會使轉化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。

1) 取新制備的一管感受態細胞。
2) 取0．03ml感受態細胞轉和4ng質粒DNA混勻，置冰浴30min。
3) 將 Ep管置于42℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘。
4) 在 Ep管中加70u1 LB培養基混勻，37℃培養30min。
5) 涂在含適當濃度抗生素的LB平板上。
6) 37℃培養過夜，長出的菌斑既為陽性克隆。

6. 線形質粒DNA 5'-粘性末端去磷酸
經限制性內切酶酶切的質粒DNA 5'端均帶有磷酸集團，如用此載體直接轉化大腸桿菌，其自身環化幾率非常高，影響連接、轉化效率。因此一般酶切的質粒DNA要經脫磷，使用堿性磷酸酶(CIAP)去除5'端磷酸集團。方法如下：
1) 質粒DNA和CIAP以及BUFFER 37℃水浴30min。
2) 補充CIAP 再37℃水浴30min。
3) 加入50mM EDTA至終濃度5mM 75℃加熱10min 失活CIAP。
4) 冷卻至室溫，酚-氯/仿抽提，乙醇沉淀濃縮。
5) 抽干溶液，加適量TE溶解。