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瓊脂糖凝膠的濃度怎么選?
點擊次數:1157 更新時間:2023-04-21

瓊脂糖凝膠電泳的原理

瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為介質,對不同大小的DNA 或 RNA 實現分離的一種電泳方法。瓊脂糖是一種多糖,具有親水性,但是不帶電荷。

使得 DNA 在堿性條件下使其帶負電荷(pH8.0 的緩沖液),在電流作用下,以瓊脂糖凝膠為介質,由負極向正極移動,根據不同的 DNA 分子片段的大小和形狀不同,在電場中泳動的速率也不相同,同時在樣品中加入染料能夠和DNA 分子間形成絡合物,經過紫外照射,可以看到 DNA 的位置,從而達到分離、鑒定的目的。


葡聚糖凝膠1.png

如何選擇瓊脂糖凝膠的濃度

目的產物大小80BP的片段,你可以用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳,瓊脂糖以及TAE的量的多少,首先與你跑得樣品的個數有關,因為你樣品的個數決定了你膠槽的體積,膠槽的體積決定了你的TAE的量,決定了瓊脂糖的量,比如說你膠槽的體積是20ml, 那么你要配2.0%的膠,就需要20ml的TAE和0.4g的瓊脂糖。

做膠的時候要注意一定要讓瓊脂糖充分溶解,可以煮沸,同時也要注意煮沸的過程中TAE的蒸發,我第一次做膠的時候,用燒瓶煮沸差點都蒸發光了;再就是加EB的時候以不燙手為標準,因為高于70度時EB會升華蒸發,過于冷卻了會使EB的濃度不均;因為EB為致癌物質,所以操作時一定要注意做好自我保護;再就是膠槽要洗干凈,梳齒一定要放正,免得跑出來的帶不整齊。

跑膠的時間和電壓成反比,電壓和電泳槽兩個電極之間的距離成正比,一般是小于5V/cm. 因為你的片段很小,所以很有可能和引物二聚體無法區分,所以你再跑電泳時時間應該適當延長一些,可以使溴芬蘭指示條帶跑過膠的2/3處,因為時間長了,因物二聚體就會跑沒了,而目的產物不會。

瓊脂糖凝膠電泳注意事項

底板一定要用膠帶封緊,否則灌膠時凝膠會漏出。可以在灌膠時先倒少量凝膠在交界處,利用凝固的凝膠將其封緊。

梳子一定不能插到底部,應距離底部1-2mm,否則拔梳子時容易弄破凝膠,導致漏膠,加熱時應注意不要讓瓊脂糖沸騰得太厲害,稍稍沸騰至溶液清涼,即其全部溶解即可,過度沸騰會導致凝膠實際濃度的提高。

將凝膠放入電泳槽時要注意極性,不要正負極顛倒。要注意撕去兩端的封帶,凝膠的濃度與待分離的DNA的大小有關。一般濃度為1%,低濃度的膠特別易碎,要注意。

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