已經(jīng)提出過(guò)許多方法用于從細(xì)菌中提純質(zhì)粒DNA， 這些方法都含有以下3個(gè)步驟：
    細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。
    細(xì)菌的收獲和裂解
    質(zhì)粒DNA的純化。

    （一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng)
    從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng))，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時(shí)，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長(zhǎng)一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入lv霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。lv霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時(shí)內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR３２２－類(lèi)的質(zhì)粒，從經(jīng)lv霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來(lái)，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的lv霉素μg/ml)已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對(duì)于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

    （二）細(xì)菌的收獲和裂解
    細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精que的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。
    1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入SDS一類(lèi)去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。
    2)可用geng劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開(kāi)。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。
    3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類(lèi)，當(dāng)隨后用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類(lèi)會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類(lèi)，而糖類(lèi)可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。
    4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒?滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟(用酚：lv仿進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。
    ５)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用lv霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用lv霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入lv霉素可以避免這種現(xiàn)象。有l(wèi)v霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加lv霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。

    (三)質(zhì)粒DNA的純化
    常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合geng多的染料，直至達(dá)到飽和( 每２個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合１個(gè)溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的lv化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，lv化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的shou選方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒。另外，現(xiàn)在已可買(mǎi)到現(xiàn)成的純化KIT。

    二、質(zhì)粒DNA的小量制備
    細(xì)菌的收獲和裂解
    收獲
    堿裂解法
    煮沸裂解
    質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備的問(wèn)題與對(duì)策
    質(zhì)粒ＤＮＡ的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法

    （一）細(xì)菌的收獲和裂解
    １．收獲
    １）將2ml含相應(yīng)抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。
    ２）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
    ３）吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。
    ２．堿裂解法
    １）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。
    溶液Ｉ
    50mmol/L葡萄糖
    25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)
    10mmol/LEDTA(pH8.0)
    溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。
    ２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
    溶液Ⅱ
    0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)?br />    1%SDS
    蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面
    均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
    ３）加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ
    溶液Ⅲ
    5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml
    冰乙酸 11.5ml
    水 28.5ml
    所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。
    蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后
    將管置于冰上３－５分鐘。
    ４）用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
    ５）可做可不做：加等量酚：lv念， 振蕩混勻， 用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心
    ２分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：lv仿進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。
    ６）用２倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置２分鐘。
    ７）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心５分鐘。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。
    ９）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。
    i.此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC），其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3－5μg。
    ii．如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于－20℃。
    iii.此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：

    ３．煮沸裂解
    １）將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。
    STET
    0.1mol/L NaCL
    10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
    1mmol/L EDTA(pH8.0)
    5% Triton X-100
    ２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
    ３）將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。
    ４）用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。
    ５）用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。
    ６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
    ７）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
    ８）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。
    ９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
    10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體（2－5）分鐘。
    11）用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
    注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下溫育（V中用限制酶時(shí)）質(zhì)粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟９）之間增加一步，即用酚：lv仿進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。