一、概念

    1、細(xì)胞系（Cell Line）：原代培養(yǎng)舞經(jīng)*傳代成功即成細(xì)胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中的細(xì)胞世系（Lineage of Cells）所組成。

    2、細(xì)胞株（Cell Strain）：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物稱為細(xì)胞株。細(xì)胞株的特殊性質(zhì)或標(biāo)志必須在整

    個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細(xì)胞株（finitecell strain）；如果可以連續(xù)傳代，稱為連續(xù)細(xì)胞株（continuous cellstrain）。對于人類腫瘤細(xì)胞，在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，并連續(xù)傳代的即可稱為連續(xù)性株或系。

    二、建立細(xì)胞系（或株）的要求

    什么樣的體外培養(yǎng)群可被認(rèn)可為己鑒定的細(xì)胞，視具體情況而定，無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)的細(xì)胞只要供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長期培養(yǎng)，特別是反復(fù)傳代的細(xì)胞，常需做如下說明：

    1、組織來源：細(xì)胞供體所屬物種，來自人體或者動物；

    個體性別、年齡；取材的器官或組織。

    如系腫瘤組織，應(yīng)說明臨床和病理診斷，以及病歷號等。

    2、細(xì)胞生物學(xué)檢測：

    了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細(xì)胞一般形態(tài)，特異結(jié)構(gòu)，細(xì)胞生長曲線和分裂指數(shù)，倍增時間，接種率等。

    如為腫瘤細(xì)胞，為說明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實(shí)驗(yàn)。

    3、培養(yǎng)條件和方法；應(yīng)說明細(xì)胞系（或株）適應(yīng)的生存環(huán)境，即指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及適宜PH值。

    三、若干細(xì)胞建株的要點(diǎn)及基本過程

    （一）腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)

    1、取材：材料主要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細(xì)胞集中和活力較好的部位，瘤性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是較好的培養(yǎng)

    材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)方法及凍存方法同前述正常組織。

    2、成纖維細(xì)胞排除：在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時能與瘤細(xì)胞同時生長，并常壓過癌細(xì)胞，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長受阻以至消失，應(yīng)仔細(xì)排除。排除方法常有：機(jī)械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。

    3、提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長率

    根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。一般當(dāng)腫瘤組成或細(xì)胞被原代培養(yǎng)后，要經(jīng)過對新環(huán)境的適應(yīng)才能生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用一些特殊措施。如：用適宜底物，鼠尾膠原底層及飼細(xì)胞底層等。用細(xì)胞生長因子，根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促細(xì)胞生長因子，如胰島素、氫化-可的松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。

    （二）人類淋巴母細(xì)胞建株方法

    l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。

    2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml淋巴細(xì)胞分離液的液面上靜置30min。

    3、1500rpm，15min，吸取白細(xì)胞層（第二層）于另一離心管中。

    4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細(xì)胞兩次。

    5、將白細(xì)胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混勻。

    6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。

    7、1500rpm，15min。將細(xì)胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37℃培養(yǎng)。

    8、5天后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l—2次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。

    9、待轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量明顯上升，并出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)塊后，可轉(zhuǎn)入25ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加1—2ml培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10—15天，一般每隔3—4天觀察一次，決定是否 換液，傳代。

    10、細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后凍存，凍存前應(yīng)進(jìn)行核型分析和存檔。