微生物細(xì)胞的固定方法有主要有物理吸附法和包埋法兩種.
1．物理吸附法
帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電相互作用,使細(xì)胞體吸附固定在硅藻土、木材、玻璃、陶瓷和塑料等載體上.如酵母細(xì)胞是帶負(fù)電的,在固定時(shí)要選擇帶正電的載體.在PH4時(shí),熱帶假絲酵母、釀酒酵母等在陶瓷表面上的吸附程度較大,載體表面的40~70%被細(xì)胞牢固吸附,不會(huì)被高流培養(yǎng)液沖掉.載體的性質(zhì)也影響細(xì)胞與載體之間的相互作用,主要是載體的成分、表面電荷、表面積和PH的影響.所有的玻璃和陶瓷都是由不同比例的氧化硅、氧化鎂等組成,如將玻璃等放在溶液中,在它的表面會(huì)發(fā)生離子交換,形成不再是鋁、硅等的氧化物,而為相應(yīng)的氫氧化物.載體表面的羥基可被微生物細(xì)胞表面的氨基或羧基所取代,在細(xì)胞與載體之間形成鍵.物理吸附法固定化活細(xì)胞的酶活性不受影響,但吸附過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜,吸附過(guò)程與微生物的性質(zhì)、載體的特性及細(xì)胞與載體之間發(fā)生的相互作用有關(guān),只有這些參數(shù)配合恰當(dāng)時(shí)才能形成穩(wěn)定的微生物細(xì)胞-載體復(fù)合物.
2．包埋法
將微生物細(xì)胞用物理的方法包埋在瓊脂、海藻酸鈉、明膠、聚丙烯酰胺和聚yi烯醇（PVA）等凝膠載體內(nèi),使微生物細(xì)胞固定化.一般的包埋成形法比較復(fù)雜、機(jī)械性能差、易磨損、不適于大批量生產(chǎn).因而近年來(lái)一些學(xué)者又研究了一種制備珠型固定化細(xì)胞技術(shù).
1）瓊脂凝膠包埋法,稱取4g瓊脂或瓊脂糖溶于50ml 0.2M pH7.0磷酸緩沖液中,加熱溶解后,冷卻到55℃左右,將細(xì)胞濃度為60%左右細(xì)菌懸浮液于40℃下保溫,然后與瓊脂溶液混合均勻.用注射器針頭將熱的混合液滴入冷的甲苯溶液,四氯乙烯溶液或液體石臘內(nèi),冷卻形成2~3mm直徑的小球.或?qū)岘傊?細(xì)菌混合液流加到攪拌下的500ml30℃的醋酸丁酯中,加完后繼續(xù)攪拌3分鐘,到混合物分散成小滴,迅速加入300ml冷的醋酸丁酯,再攪拌2~5分鐘,傾去醋酸丁酯,抽濾干,用緩沖液洗至無(wú)醋丁酯味,即制成珠型固定化細(xì)胞,小珠約在1~3mm.使用前將球形固定化細(xì)胞放入消毒好營(yíng)養(yǎng)液中30℃活化24小時(shí)后再用.
2）海藻酸鈣凝膠包埋法 稱取2g海藻酸鈉,加30ml生理鹽水于高壓滅菌鍋中加熱溶解、冷卻到40℃,取20ml與20ml細(xì)胞濃度為50%的細(xì)菌懸浮混合均勻,然后用注射器針頭滴加到0.1M氯化鈣或4%的氯化鋇溶液中,邊滴邊搖,使其形成2mm直徑球型小珠,然后用生理鹽水洗滌.或?qū)⒒旌弦毫骷拥綌嚢柘碌?00~500ml醋酸丁酯中,當(dāng)分散成小滴后,迅速加入5ml 0.1M的二氯化鈣溶液,繼續(xù)攪拌5~10分鐘,自然沉降,傾去醋酸丁脂,再加入50ml 0.1M的二氯化鈣溶液,浸泡1小時(shí),進(jìn)一步固化,然后用蒸餾水*洗滌,即得直徑為1~3mm珠型固定化細(xì)胞.干后可保存于低溫下,使用前需放入消毒好的營(yíng)養(yǎng)液中30℃活化24小時(shí)后再用.由于磷酸鹽會(huì)破壞凝膠的結(jié)構(gòu),因而在使用海藻酸鈉固定細(xì)胞時(shí)盡量防止磷酸鹽的加入.
3）明膠包埋法 稱取6g明膠,加入50ml 0.1M pH7.0的磷酸緩沖液,加熱溶解后冷卻至40℃,取20ml與20ml細(xì)胞濃度為60%的細(xì)菌懸液在40℃混合均勻,冷卻凝固后切成1~2mm3方塊,然后再加2.5%戊二醛,使包埋塊懸浮在戊二醛溶液中,室溫下輕輕攪拌4小時(shí)進(jìn)行交聯(lián),濾去戊醛后,逐次用0.1M氯化鈉和去離子水洗滌后即成.或者將明膠-菌體混合液流加到200ml 20℃攪拌下的醋酸丁酯溶液中,當(dāng)分散成小珠后,迅速加入5ml 5%的戊二醛溶液,繼續(xù)攪拌5~10分鐘,傾去醋酸丁酯,水洗即得到珠型固定化細(xì)胞,再放入50ml的pH5.0的戊二醛溶液中浸泡30分鐘,然后*洗滌,即獲得直徑1~3mm的球形小珠.使用前將其放入營(yíng)養(yǎng)液中30℃活化24小時(shí)后再用.用戊二醛交聯(lián)的明膠包埋法,可獲得機(jī)械強(qiáng)度及工作穩(wěn)定性較好的固定化細(xì)胞.
4）聚丙烯酰胺凝膠包埋法,引此法是較常用的一種包埋法.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠.常用的催化劑和加速劑是過(guò)硫酸銨和四甲乙二胺或三乙醇胺.
稱取17.6g丙烯酰胺和1.2g N—N′—甲叉雙丙烯酰胺溶于0.05M pH7.0的Tris-HCl緩沖液中,取20ml與5g的濕菌泥混合均勻,加入50μl的40%過(guò)硫酸銨,混合均勻后流加到攪拌的豆油或液體石蠟中,攪拌分散成小滴,迅速加入250μl的四甲基乙二胺,小滴即很快聚合形成小珠,傾去流體,用水或緩沖液充分洗滌即可獲得珠型固定化細(xì)胞.或?qū)⒕嗷旌弦杭尤?%過(guò)硫酸銨0.25ml和10%三乙醇胺4 ml,將上述混合液攪拌均勻,不要出現(xiàn)氣泡,置于40℃恒溫浴中30分鐘左右,即形成聚內(nèi)烯酰胺凝膠固定化細(xì)胞,在凝膠未干時(shí)切成2~3mm3小塊,于50~60℃中干燥后保存.使用前將包埋好的固定化細(xì)胞放入消毒后的營(yíng)養(yǎng)液中活化24小時(shí)再用.最chang用的是包埋法.
