WB 是檢測和定量磷酸化蛋白質的重要實驗方法，然而大家一直都說磷酸化蛋白 WB 不好做！WB 磷酸化蛋白曝不出條帶的時候，會特別沮喪。

遠慕在此給大家列出幾點小建議，希望能幫助您改善一下實驗結果。

1、樣本是否表達：
查閱資料或通過預實驗確定。

2、對照設置：
陽性和陰性對照。
總蛋白抗體對照，對于特定時間的特定樣品，磷酸化和非磷酸化蛋白質的總和代表該特定蛋白質的總量。在相同的 WB 檢測中， 磷酸化蛋白質的量增加通常伴隨著非磷酸化蛋白質的降低。

3、內參設置：
根據實驗選擇合適的內參，如Actin、GAPDH 等

4、適當的提取方法：
蛋白質提取的方法不僅影響提取效率，還會影響蛋白的質量。建議采用裂解液裂解和超聲破碎組合的方式，可確保整個樣本充分裂解。

5、低溫操作：
室溫條件下，磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。請勿反復凍融，操作時一定置于冰上。

6、加入抑制劑：
組織或細胞裂解時會釋放出大量內源性蛋白磷酸酶，它會導致磷酸化蛋白的去磷酸化，因此，必須在裂解液中加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑。

7、最重要的一點：
檢測時選擇近紅外熒光標記抗體，一次可檢測多個蛋白，無需多次曝片，方便檢測。一般磷酸化和總蛋白的條帶位置十分接近，傳統方式不易區分。

這樣大家在用WB檢測磷酸化水平時，是不是就方便多了，不用像傳統方法那樣，在壓完磷酸化抗體后，將膜 strip 后再壓總蛋白抗體；也不需要同時跑兩塊膠分別檢測。

使用近紅外熒光標記抗體（二抗），孵育后直接放入儀器，一鍵成像，簡單快速！