使用分光光度計測定蔗糖含量
點擊次數：582 更新時間：2022-06-02
使用分光光度計測定蔗糖含量
酶是非常有用的助手，憑借其*的專一性和重現性能夠檢測到所需的分子。正是因為有此特性，他們可制作成檢測試劑盒，用來檢測果汁、紅酒、啤酒、雞蛋和肉類等各類食品的各種底物如糖和其它碳水化合物、酸和醇等。酶試劑盒受歡迎還因為它有如下優點：首先，和其它測試方法比起來它的樣品制備快速且簡單。其次，每次測試的成本非常低測試不需要任何危險試劑。酶試劑盒的原理是基于輔酶系統煙/酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH）的顏色變化進行檢測 – 還原態(NADH)在340nm有光譜吸收。我們通過檢測軟飲料中的蔗糖含量來舉例說明。蔗糖被酶分解成葡萄糖和果糖。然后通過己糖激酶將葡萄糖和果糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。另外一種酶將葡萄糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡萄糖。在后一個反應中，輔酶NAD被還原成NADH。NADH的生成可以通過測量340nm的吸收峰檢測到，它直接與樣品中的蔗糖含量成比例。然而，由于大部分樣品不僅含有蔗糖，也含有葡萄糖，而且葡萄糖也會代謝產生NADH，因此在計算中必須減去葡萄糖的量。
酶是非常有用的助手，憑借其*的專一性和重現性能夠檢測到所需的分子。正是因為有此特性，他們可制作成檢測試劑盒，用來檢測果汁、紅酒、啤酒、雞蛋和肉類等各類食品的各種底物如糖和其它碳水化合物、酸和醇等。酶試劑盒受歡迎還因為它有如下優點：首先，和其它測試方法比起來它的樣品制備快速且簡單。其次，每次測試的成本非常低測試不需要任何危險試劑。酶試劑盒的原理是基于輔酶系統煙/酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD/NADH）的顏色變化進行檢測 – 還原態(NADH)在340nm有光譜吸收。我們通過檢測軟飲料中的蔗糖含量來舉例說明。蔗糖被酶分解成葡萄糖和果糖。然后通過己糖激酶將葡萄糖和果糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。另外一種酶將葡萄糖-6-磷酸轉化成6-磷酸葡萄糖。在后一個反應中，輔酶NAD被還原成NADH。NADH的生成可以通過測量340nm的吸收峰檢測到，它直接與樣品中的蔗糖含量成比例。然而，由于大部分樣品不僅含有蔗糖，也含有葡萄糖，而且葡萄糖也會代謝產生NADH，因此在計算中必須減去葡萄糖的量。
實驗過程
進行測試時，作為對照品的蔗糖標準品和相應的空白必須根據試劑盒制造商的要求在標準1cm石英比色皿中制備，此次實驗使用的是遠慕生物試劑盒，如下表所示。
比色皿 | 蔗糖分析試劑[mL] | 樣品量[mL] | 水[mL] |
蔗糖分析試劑空白 | 0.1 | - | 0.1 |
葡萄糖分析試劑空白 | - | - | 0.2 |
對照品空白 | - | 0.1 | 0.1 |
對照品測試 | 0.1 | 0.1 | - |
樣品空白 | - | 0.1 | 0.1 |
樣品測試 | 0.1 | 0.1 | - |
將每個比色皿中物質混合均勻并在室溫靜置10分鐘。然后將2.0 mL葡萄糖分析試劑加入到每個比色皿中，混合均勻并在室溫再靜置15分鐘。
如果儀器配備了自動多聯池，可以一次加載所有的空白、對照品和樣品，使得測量流程變得更便利。
通過下面公式計算得到蔗糖濃度。首先計算總空白，它包括了樣品和試劑的吸光度：
A(總空白)=A(樣品/對照品空白)+A(蔗糖分析試劑空白)-A(葡萄糖分析試劑空白)
對于樣品和對照品，因生成NADH產生的吸光度差值可如下計算：
ΔA=A樣品/對照品測試-A總空白
現在就可以計算得到蔗糖濃度了：
（ε：蔗糖的吸光系數，d：光程）
總結：蔗糖含量可以很容易的使用酶試劑盒和紫外可見分光光度計進行測量。酶分析強大之處在于高專一性和靈敏性，可以分辨蔗糖和其它糖分子如葡萄糖和果糖。酶分析可以廣泛用于飲料和其它食品。
