四環素類抗生素的測定方法主要包括微生物抑制法、charmⅡ微生物受體分析法、酶聯免疫法、分光光度法、毛細管電泳色譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜法等。

樣品經過提取和凈化后，四環素類抗生素可通過薄層色譜或液相色譜進行分離，再采用分光光度、熒光或質譜檢測系統進行定量測定。

微生物法是一種傳統的測定四環素類化合物和其他抗生素的分析方法。微生物通常對四環素類抗生素具有固有的敏感性．對某些四環素別敏感，因而世界范罔內仍然在使用微生物抑制法。蠟狀芽孢桿菌ATCC 11778是一種經典的用于分析四環索類的微生物，其對金/霉素的靈敏度為0.005 mg/L，對四環素和土/霉素的靈敏度為0．025 mg/L，對二甲胺四環素的靈敏度為0.001～0.002 mg/L。相對于其他分析方法，微生物抑制法操作簡便，價格低廉，不需要精密儀器和復雜的樣品前處理過程，因而適合大量樣品的篩選。微生物抑制法的最大缺點是不能區分具體的四環素種類，因此也難以進行定量檢測。

間接酶聯免疫法可用來檢測牛奶中的四環素類抗生素。四環素牛血清白蛋白共軛物用于抗體制備，同源的四環素-酪蛋白共軛物作為包埋試劑，而羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶作為第二抗體。牛奶樣品經離心脫脂，采用磷酸鹽緩沖液至少以l：30的比例進行稀釋后，直接采用酶免疫法進行測定，檢測限可達5 ng/g由于該法所采用抗體與金/霉素有強烈的交叉反應活性，因此，該法雖然不是用來檢測四環素類的，但對于金/霉素的檢測限也低達5 ng/g。劉智宏等建立了牛奶和雞肉中四環素、土/霉素、金/霉素和多兩環素的ELISA檢測方法。該方法對牛奶和雞肉中四環素的檢測限為7μg/L(μg/kg)左右。由于存在交叉反應、假陽性率高等原因，免疫法一般作為四環素類物質檢測的初篩方法。