1. 多肽含量與多肽純度有什么區(qū)別?

　　一條多肽產(chǎn)品中除了多肽本身還包括生產(chǎn)過(guò)程中帶入的水份及有機(jī)鹽分等雜質(zhì)，多肽純度僅指多肽本身所含肽產(chǎn)品的含量及雜質(zhì)的含量，不包括水份等雜質(zhì);而多肽含量則是指目標(biāo)多肽在產(chǎn)品中的凈含量，一般以N元素分析或氨基酸分子的方法來(lái)檢測(cè);因此一條多肽即使純度達(dá)到99%，因?yàn)楫a(chǎn)品中還包含水份及有機(jī)鹽分等，它的含量可能也只有70-80%。

　　2 如何溶解多肽?多肽樣品在上制備柱前為什么需要進(jìn)行前處理?有哪些前處理的方法?

　　多數(shù)多肽都可以用超純水溶解，對(duì)于一些難溶的多肽，先要分析其氨基酸序列，對(duì)于酸性多肽，可先以小量堿性(如0.1%氨水)溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于堿性多肽，可先以小量酸性(如醋酸，三氟/乙酸)溶液溶解，然后稀釋至所需濃度，對(duì)于疏水性多肽，可用強(qiáng)極性有機(jī)溶劑溶解，如DMF，甲醇，丙醇，異丙醇，DMSO等。制備色譜柱子由于處理的樣品多，比分析柱子更容易受污染，因此有必要對(duì)樣品進(jìn)行前處理以有效延長(zhǎng)制備柱的壽命。主要方法有5種：萃取、過(guò)濾、離心、上預(yù)柱、加在線過(guò)濾器。

　　3. 為什么流動(dòng)相中要加入三氟乙/酸作為離子對(duì)試劑，還有哪些流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑可用于多肽的分離純化?

　　目前常用的流動(dòng)相體系是水加乙腈，以三氟乙/酸(TFA)為離子對(duì)試劑，根據(jù)不同多肽以合適的梯度洗脫分離多肽。加入三氟乙/酸能調(diào)節(jié)洗脫液的PH，同時(shí)作為離子對(duì)試劑與多肽相互作用，從而增強(qiáng)分離效果，明顯改善峰形。其它可用于多肽分離純化的流動(dòng)相體系或離子對(duì)試劑包括醋酸體系，磷酸體系，鹽酸體系，七氟丁酸等通過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)PH都能取得很好的分離效果。

　　4. 如何選擇純化過(guò)程中使用的色譜柱填料?

　　不同序列的多肽理化性質(zhì)及疏水性有很大的區(qū)別，多數(shù)情況分子量小于4000和親水性多肽用C18柱分離效果/最佳，分子量大于5000和極/端疏水性的多肽以C4柱分離效果/最佳，而C8柱介于C18和C4柱之間，其應(yīng)用效果與C18柱更相似;對(duì)一些特殊選擇性的多肽，也可選擇苯基柱和聚合物色譜柱。

　　5. 在純化過(guò)程中選擇聚合物填料的原則是什么?

　　需要使用高于正常pH或溫度條件進(jìn)行純化時(shí)，可以使用pH范圍極寬的聚合物色譜柱，它的優(yōu)點(diǎn)就是在極/端pH條件下不會(huì)降解，可以使用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿作為流動(dòng)相進(jìn)行分離純化。

　　6. 影響多肽純度檢測(cè)結(jié)果的因素

　　影響多肽純度檢測(cè)結(jié)果的因素很多，主要包括：流動(dòng)相體系、色譜柱型號(hào)、柱溫、波長(zhǎng)及色譜儀的性能指標(biāo)，每一項(xiàng)不同都可能造成結(jié)果產(chǎn)生誤差。

　　7. 在多肽檢測(cè)過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)基線漂移的原因是什么?怎么解決?

　　固定三氟乙/酸濃度的梯度洗脫有時(shí)會(huì)在210-220nm檢測(cè)處造成吸收基線的漂移，這是許多反相分離中基線漂移的原因。降低或消除由于三氟/乙酸光譜吸收變化引起的基線漂移需要盡量使檢測(cè)波長(zhǎng)靠近215nm，并在溶劑B中比在溶劑A中少加15%的三氟乙/酸補(bǔ)償基線漂移。例如溶劑A中的三氟/乙酸為0.1%時(shí)，溶劑B中可用0.085%。

　　8. 反相色譜分離純化后，怎樣去除產(chǎn)品中流動(dòng)相產(chǎn)品中的TFA，乙腈等雜質(zhì)?

　　凍干的辦法應(yīng)該可以除去大多數(shù)TFA和乙腈，只要不超過(guò)允許范圍，這種辦法是最簡(jiǎn)/單、有效的。對(duì)TFA含量要求更高的一些藥物肽凍干的方法一般無(wú)法*達(dá)到要求，需要進(jìn)行專門的轉(zhuǎn)鹽或脫鹽。

　　9. 多肽一般有哪幾種鹽的形式?通過(guò)什么方式轉(zhuǎn)鹽或脫鹽?

　　多數(shù)多肽都是在TFA體系下分離純化的，所以多肽以TFA鹽的形式最多，其次藥物肽一般有醋酸鹽及鹽酸鹽的形式，極少數(shù)藥物肽會(huì)有一些特殊的鹽形式。轉(zhuǎn)鹽方式多為離子交換法和HPLC法，而脫鹽可用透析袋和超濾膜。

　　10. TFA在緩沖液中是不是只起到調(diào)節(jié)PH的作用?TFA的濃度越高基線漂移越厲害，那是不是說(shuō)TFA的濃度在緩沖液PH允許的情況下越低越好?

　　(1)TFA起到類似離子對(duì)的作用，一般濃度在0.05-0.1%，過(guò)高的濃度，會(huì)使溶液偏酸，長(zhǎng)時(shí)間使用可能影響柱子壽命。

　　(2)同時(shí)TFA可以抑制硅膠表面硅醇基，改善堿性化合物的峰型。有時(shí)0.1%TFA分離不好的話。可以考慮加大濃度到0.2%。但要注意用完后及時(shí)沖洗色譜柱。

　　(3)走梯度時(shí)，因?yàn)樽叱苫€漂移，但對(duì)制備的影響不大。